近日，上海科技大学免疫化学研究所大分子药物递呈实验室刘佳副研究员与功能筛选实验室马培翔副研究员合作，报道了第一个能够以变构方式抑制CRISPR-Cas9活性、来源于丝状噬菌体的天然多肽G8PPD。该研究成果以“Allosteric inhibition of CRISPR/Cas9 by bacteriophage-derived peptides”为题，于2020年2月26日在国际知名学术期刊Genome Biology上在线发表。
作为新兴技术，CRISPR-Cas9在人类疾病治疗中具有广泛的应用前景。临床方案中，CRISPR-Cas9通常为组成型表达，而过度的Cas9核酸酶积累会导致其脱靶效应升高，成为治疗中的安全隐患。此前已经发现了来源于噬菌体自身的、与细菌CRISPR系统具有“军备竞赛”性质的抗CRISPR蛋白（Anti-CRISPR proteins, Acrs）。实验证明，这些Acr蛋白能通过时像调控增加CRISPR-Cas9靶向的特异性。同时，高通量筛选也鉴定了一系列具有CRISPR-Cas9抑制活性的小分子化合物。本研究报道的丝状噬菌体多肽，有别于此前报道的CRISPR-Cas9系统的小分子和蛋白质抑制剂，能通过变构调节来抑制Cas9活性，因此在已知的CRISPR-Cas9抑制剂中显得尤为独特。
在该研究中，研究者首先意外发现M13噬菌体本身能够抑制SpyCas9核酸酶的体外切割活性；随后的进一步研究发现，噬菌体对SpyCas9活性的抑制来源于噬菌体的主要外壳蛋白G8P的周质结构域（periplasmic domain），即G8PPD。体外切割显示，G8PPD多肽只能抑制apo形式的SpyCas9（无DNA和sgRNA），而这种抑制并非是通过与sgRNA的直接竞争实现。后续的质谱和突变分析表明，G8PPD与SpyCas9的结合位点在PAM interacting（PI）结构域，远离sgRNA及DNA结合位点，故此G8PPD很可能是通过变构调节来实现对SpyCas9的抑制。与体外实验一致，G8PPD在人细胞中对SpyCas9活性的抑制需要在Cas9/sgRNA转染前提前进行过表达；而G8PPD与Cas9/sgRNA同时转染时，可通过对SpyCas9的时像调控提升其在人细胞中的特异性，这为开发用于精准基因编辑的新一代CRISPR-Cas抑制剂提供了思路。
图1. M13噬菌体和噬菌体衍生的G8PPD多肽可抑制SpyCas9的体外切割。
a, M13噬菌体对SpyCas9的剂量依赖性抑制作用。b, M13噬菌体不抑制组装的Cas9/sgRNA RNP的体外活性。c, M13噬菌体主要外壳蛋白G8P的结构域示意图。d. G8PPD对SpyCas9的剂量依赖性抑制作用。e. G8PPD不抑制组装的Cas9/sgRNA RNP的体外活性。
上海科技大学免疫化学研究所为第一完成单位，上海科技大学博士研究生崔炎濡和大分子药物递呈实验室工程师王少杰为共同第一作者，刘佳副研究员与马培翔副研究员为共同通讯作者。该项工作得到了中国国家自然科学基金的支持，上海科技大学免疫化学研究所抗体化学实验室、分析化学平台和高通量筛选平台对本项研究提供了大力支持。
论文链接：https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-020-01956-x
